文章出處：
中國組織工程研究 第16卷 第35期 2012-08-26初版
齊進，黃萍，張連方，豐盛梅，鄧廉夫
文章亮點：
①采用EXAKT切磨系統(tǒng)技術(shù)能制作出高質(zhì)量的軟、硬組織薄層切片。
②EXAKT 切磨系統(tǒng)可清晰顯示各種組織結(jié)構(gòu)和人工植入物。
文章概要: 
實驗對做形態(tài)計量觀察的骨標本和含金屬植入物的軟硬組織標本采用不脫鈣有機玻璃包埋技術(shù)進行處理。實驗采用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制作皮質(zhì)骨和含金屬植入物的軟硬組織切片，能獲得厚薄均一的5-10μm薄切片。實驗發(fā)現(xiàn)EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制作的薄切片在高倍鏡下更容易聚焦，可清晰顯示組織結(jié)構(gòu)及熒光標記。
背景：
目前常用的Polycut 硬組織切片機難以制作皮質(zhì)骨或含堅硬植入物組織的薄層切片，近年來這些切片多用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)進行制作。
目的：
實驗采用EXAKT切磨系統(tǒng)制作含金屬內(nèi)植物的軟、硬組織薄層切片。
方法：
取大鼠股骨遠端、小鼠股骨干骨折部、帶有鈦金合金種植體的犬下頜骨和帶有鈷鉻支架的豬冠狀主動脈標本，經(jīng)多聚甲醛固定和丙酮脫水后用有機玻璃（甲基丙烯酸甲酯）浸透包埋。組織包埋塊用EXAKT系統(tǒng)作厚度約300μm的切片，然后磨片至5-10μm的切片。不同切片用蘇木精-伊紅和甲苯胺藍染色后在光學顯微鏡下觀察形態(tài)。
結(jié)果與結(jié)論：
甲苯胺藍染色顯示，大鼠股骨遠端骨組織切片中干骺端礦化骨小梁呈淺藍色、皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)完整，無碎裂。含帶有鈦合金種植體的犬下頜骨切片淺藍色宿主骨與黑色金屬種植體密切結(jié)合，形成牢固的界面。四環(huán)素標記的小鼠股骨干骨折部骨痂切片，在熒光顯微鏡（紫外光）下顯示明顯的雙層熒光帶。蘇木精-伊紅染色的包裹鈷鉻合金支架的豬冠狀動脈組織切片顯示，支架材料維持原味，與血管壁無脫離或游離現(xiàn)象，組織無皺紋或折疊。結(jié)果提示，采用EXAKT切磨系統(tǒng)技術(shù)能制作出高質(zhì)量軟、硬組織薄層切片，可清晰顯示各種組織結(jié)構(gòu)和人工植入物。
關(guān)鍵詞：
EXAKT切磨系統(tǒng)；骨；植入物；有機玻璃；切片；骨組織構(gòu)建

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對含熒光素標記的骨組織常用Polycut硬組織切片機進行切片，優(yōu)點是能切5-10μm厚的切片，清晰顯示骨結(jié)構(gòu)和熒光標記[1-3]，缺點是切堅硬的皮質(zhì)骨易發(fā)生骨碎裂，導致切片質(zhì)量較差，并且不能切割金屬植入物。因此，切皮質(zhì)骨和含金屬植入物的骨標本常用Leica菇切片機或慢速金剛環(huán)鋸[4-6]。這些器械切出的切片較厚，常超過100μm，需要用磨片機甚至手工進行磨片[4-6]。這樣摸出的切片厚度不一，甚至產(chǎn)生同意切片不同部位的厚薄不勻，導致鏡下觀察時難以聚焦，影響照片質(zhì)量。對于這些常規(guī)設(shè)備難以制作的硬組織切片，目前多用德國EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)進行制備[7-9]，這些切片能達到＜20μm的厚度，并保持硬組織，組織與植入物之間的原有組織結(jié)構(gòu)形態(tài)。

實驗室介紹采用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制備皮質(zhì)骨及含內(nèi)植物軟硬組織薄切片的計提方法及可能達到的效果。
1、材料和方法
設(shè)計：組織學實驗。
時間及地點：于2008/2011上海市傷骨科研究所實驗室收集。包括：①3月齡雌性SD大鼠的股骨遠端組織標本。②含四環(huán)素雙標記的3月齡小鼠股骨干骨折部骨痂組織標本。③含鈦合金合金種植體的雄性犬下頜骨組織標本。④含植入鈷鉻合金支架的雄性豬冠狀動脈組織標本。
主要試劑和儀器：

方法：
組織固定、脫水和包埋：新鮮組織塊至于40g/L多聚甲醛固定液中固定48h后流水沖洗24h，在EXAKT 510脫水儀中用100%丙酮溶液脫水。脫水后將組織塊植入塑料模具，在EXAK T520光固化包埋機中做有機玻璃包埋。

組織切片：有機玻璃聚合后去除塑料模具，用Technovit 4000黏合劑將有機玻璃包埋樣本黏于載玻片A。將載玻片A真空吸附于EXAKT 300CP切片機夾具上，通過激光在包埋標本上定位，用金剛鋸條切割暴露標本表面。將載玻片A吸附于EXAKT 400CS磨片機對標本表面進行拋光。在EXAKT 401載片黏合裝置張用Technovit 7210VLC膠水將載玻片B合成一個類似于三明治的結(jié)構(gòu)。將三明治結(jié)構(gòu)的載玻片A側(cè)吸附于EXAKT 300CP切片機夾具上，從載玻片B側(cè)通過自動步進定位裝置切割厚度約300μm的切片。

把黏附切片的載玻片B吸附于待滾動磨盤裝置和電子測量控制系統(tǒng)的EXAKT 400CS微磨片裝置，針對不同標本預先設(shè)定磨片的厚度。在各級SiC&Al?O?砂紙上磨片至預定厚度，最后用細砂紙對切片表面進行拋光。整個過程通過AW100測量控制系統(tǒng)進行控制。實驗的切片最終厚度為5-10μm。
切片染色方法：
蘇木精-伊紅染色：將蘇木精直接滴加于植入鈷鉻支架的豬冠狀動脈切片組織表面，視標本類型掌握染色時間，通常5-30min，流水清洗殘留染液后切片植入體積分數(shù)1%鹽酸乙醇30S，流水沖洗后再入溫水返藍，而后進入伊紅復染1min，自然干燥后直接用BASO病理封固膠封固，光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)。
甲苯胺藍染色：將體積分數(shù)1%甲苯胺藍染液直接滴加于大鼠股骨遠端骨組織切片和含帶有鈦合金種植體的犬下頜骨切片表面5-30min(染色時間視標本類型而定)，流水沖洗，待自然干燥后直接用BASO病理封固膠封固。不染色切片直接用BASO病理封固膠封固，光學顯微鏡下觀察各組組織形態(tài)。
采用免疫熒光染色觀察小鼠股骨骨折骨痂組織形態(tài)，熒光顯微鏡下觀察組織形態(tài)。
主要觀察指標：各組染色標本內(nèi)的顯微結(jié)構(gòu)，不同軟硬組織切片的顯示效果。

2、結(jié)果
2.1切片質(zhì)量控制結(jié)果 各種骨標本及含內(nèi)植物的軟、硬組織標本，經(jīng)有機玻璃包埋后，均可通過EXAKT切磨系統(tǒng)制作出5-10um厚的薄切片。由于磨片厚度經(jīng)螺旋測微器自行測量，因此切片各部位厚度均一(差別不超過+0.01微米)，且切片表面光整。光鏡下聚焦后各部位結(jié)果均能清晰顯示。

2.2不同軟硬組織切片的顯示效果 甲苯胺藍染色的大鼠股骨遠端骨組織切片顯示，切片中干骺端礦化骨小梁呈淺藍色、而未礦化的骨小梁表面類骨質(zhì)及骺板軟骨基質(zhì)呈深藍色：淺藍色的皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)完整，無碎裂，見圖1。

四環(huán)素標記的小鼠股骨骨痂切片(未作其他染色)顯示，在熒光顯微鏡(紫外光)下顯示明顯的雙層熒光帶，據(jù)此可測定新骨形成和骨改建，見圖2。

甲苯胺藍染色后的含螺紋狀金屬種植體的犬下頜骨切片顯示，金屬種植體保持在原位，淺藍色宿主骨與黑色金屬種植體密切結(jié)合，形成牢固的界面，見圖3。

蘇木精-伊紅染色的包裹鈷鉻合金支架材料的豬冠狀動脈組織切片顯示，支架材料維持在原位，與血管壁無脫離或游移現(xiàn)象，組織無皺縮或折疊，見圖4。

3、討論
骨是一種堅硬的結(jié)締組織，如做石蠟切片，需先進行脫鈣。雖然脫鈣骨切片常用于觀察骨的細胞變化[10]，但脫鈣過程可引起組織結(jié)構(gòu)皺縮，影響骨結(jié)構(gòu)的定量分析。更重要的是以四環(huán)素為代表的骨熒光標記物與新骨內(nèi)鈣鹽鰲合[11-12]，脫鈣可使熒光標記消失，影響對骨改建的動態(tài)分析。因此，對做形態(tài)計量觀察的骨標本采用不脫鈣有機玻璃包埋技術(shù)進行處理[13-14]。有研究對含金屬植入物的骨標本也采取不脫鈣技術(shù)進行處理[15]，主要有2個原因:①脫鈣不能軟化金屬植入物。②脫鈣引起的骨組織皺縮可引起骨-植入物界面分離，不能反映愈合過程中植入物與骨的結(jié)合情況。
雖然不脫鈣的有機玻璃包埋能夠維持硬組織(骨、牙)和金屬植入物的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性，但切片技術(shù)往往是保證觀察質(zhì)量的關(guān)鍵。最多用于硬組織切片的是德Polycut硬組織切片機，可切5-10μm的薄切片。除了實驗研究外，該切片技術(shù)在臨床上廣泛用于髂骨活檢標本[16-17]。
髂骨活檢結(jié)果既是診斷骨質(zhì)疏松和多種骨病的金標準，而且也是評判治療效果的重要指標[18]。髂骨活檢前一段時間服用2次四環(huán)素進行新骨雙重標記，使新骨形成區(qū)有兩條熒光條帶[17-19]。骨結(jié)構(gòu)和靜態(tài)骨改建參數(shù)的測定在甲苯胺藍染色切片上進行，而動態(tài)骨改建參數(shù)依靠在未染色切片上測量四環(huán)素熒光條帶的長度和兩條條帶的間距。熒光標記在薄切片中的清晰度遠優(yōu)于厚切片。
然而，Polycut切片機適用于髂骨這類含大量松質(zhì)骨和較疏松皮質(zhì)骨的部位[20]，不適合切致密皮質(zhì)骨，更不能切割堅硬的金屬植入物。因此，許多研究采用慢速金剛環(huán)踞切割皮質(zhì)骨或含金屬植入物骨標本[5-6]。但用環(huán)踞切出的切片往往大于100μm，經(jīng)磨片也只能達到50μm，而且磨片厚度不易掌握。這種厚片內(nèi)的結(jié)構(gòu)較難聚焦，尤其是骨內(nèi)熒光標記，常會影響測試的精確性。目前越來越多學者用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制作皮質(zhì)骨和含金屬植入物骨切片[7-9]。該系統(tǒng)對切、磨片厚度均可精確調(diào)控，最終片厚可達5-10μm，且厚度均一。實驗發(fā)現(xiàn)用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制備的薄層骨切片在顯微鏡下容易聚焦，由于切片各部位厚度均勻，較少出現(xiàn)聚焦困難的現(xiàn)象。因此，即使在高倍鏡下也可顯示清晰的骨結(jié)構(gòu)和熒光標記。此外由于骨結(jié)構(gòu)形態(tài)保持完好，該切片還適用于觀察金屬內(nèi)植物與骨的界面情況，這對研究骨內(nèi)植物的愈合具有重要意義。
對軟組織作顯微鏡觀察一般采用石蠟切片，但在植入鈷鉻合金支架的情況下石蠟切片不一定適用。原因是石蠟切片刀難以切動較硬的合金支架，硬切容易造成支架變形或碎裂。此外，支架和動脈組織硬度不一，在切片時容易造成2者分離。因此需要尋找一種新的方法來處理這種標本。實驗對植入鈷鉻合金支架的豬冠狀動脈采用硬組織切片方法進行處理取得了良好的效果。鏡下顯示支架及動脈結(jié)構(gòu)完好，兩者呈密切結(jié)合。本次實驗結(jié)果提示對含有金屬材料的軟組織可用有機玻璃包埋方法。有機玻璃浸透可增加軟組織的硬度，在切片時不易發(fā)生變形。對這種有機玻璃組織包埋塊用 EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制作切片可獲得滿意的觀察效果。因此，實驗為觀察含金屬支架的軟組織提供了一個有效的方法。
綜上所述，EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)適用于制作皮質(zhì)骨和含金屬內(nèi)植物組織的薄層切片，這種切片可做各種染色進行定量組織形態(tài)觀察，可廣泛應(yīng)用于骨科、口腔、腫瘤、心血管及整形外科等研究領(lǐng)域。

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